BCA蛋白定量试剂盒

产品描述：

Bicinchoninic acid (BCA)法是广为应用的蛋白浓度定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质肽键结构与Cu²⁺络合，并将Cu²⁺还原成Cu⁺。BCA可特异性结合Cu⁺并形成稳定的紫蓝色复合物，并在562 nm处有最大的光吸收值，该复合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可以根据吸收值的大小来测定蛋白的含量。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，形成的紫蓝色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质的影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。本品可进行500次微板(Microplate)测定或100次比色杯(1 mL)测定。

产品组成与储存：

1. BCA试剂：100 mL，室温保存。

2. Cu试剂：2.5 mL，室温保存。

3. BSA标准品(4 mg/mL, 1 mL)，-20℃保存，一年有效。

可进行500次微板(microplate)测定或100次1 ml比色杯测定。

所需设备：比色计、酶标仪或微板比色仪，最佳工作波长562 nm，可在540-590 nm 之间。

使用说明：

1. 工作溶液(Working Reagent, WR)配制：将BCA试剂与Cu试剂按照50:1比例混合，即为WR工作溶液。该工作溶液呈嫩绿色，室温一周内稳定。

2. 标准蛋白溶液配制：使用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS或与待测蛋白样品匹配的裂解液对BSA标准品（4 mg/mL）进行倍比稀释，获得到BSA标准溶液浓度为1600、800、400、200、100、50、25 µg/mL。通常样品蛋白浓度不会太高，可省略1600 µg/mL标准管而直接从1000或800 µg/mL开始配制，可节省BSA标准品的用量。

3. 根据表1进行反应体系配制：

表 1   标准测定和微板测定方案的加样量和比例

a. 对于微板测定：使用96孔板，将25 µL BSA标准品或待测样本与200 µL WR工作溶液混合，酶标仪、微板比色仪测定。

b. 对于标准比色杯测定：使用1 cm光程玻璃或塑料比色皿，将0.05～0.1 mL BSA标准品或待测样本与1 mL WR工作溶液混合，比色计测定。

c. 37℃反应30分钟(也可25℃室温2小时或过夜)。60℃ 30 min反应可增加检测灵敏度至5～250 µg/mL。

d. 样品冷却至室温，测定562 nm处(可在540～590 nm之间)的光密度(OD)值。

e. 绘制标准曲线。X轴为BSA标准品浓度(mg/mL或µg/mL)，Y轴为各标准管对应的OD₅₆₂值。以线性拟合并计算待测样品的蛋白浓度。

注意事项：

1. 37℃ 30分钟或25℃室温反应2小时对测量较为便利，但严格来讲此时反应尚未达到终点，通常每10 min OD₅₆₂值升高约2.3%。然而，通常在10 min内可以测定30管并不会明显影响测定精度。

2. BCA法检测蛋白浓度范围为20～2000 µg/mL。60℃反应30分钟可增加检测灵敏度至5～250 µg/mL。检测0.5～10 µg/mL高度稀释蛋白样品应采用Bradford法定量试剂盒。

3. BCA法检测样品中含有脂类物质时光吸收值会偏高，因此样品中EDTA或葡萄糖浓度大于10 mM时不能使用BCA方法检测蛋白浓度。葡萄糖浓度大于10 mM时可用改良Lowry法蛋白定量试剂盒，EDTA大于10 mM的样品可用Bradford法蛋白质定量试剂盒。

4. 欲使测量能耐受表2所提示的干扰物质同时保持测量精度，应在蛋白标准管中加入相应浓度的干扰物质，但会给操作带来不便。

5. 本品可检测吸附于固相支持物乳酶标板、琼脂糖、亲和层系凝胶上的蛋白。

6. 每次测定样品的蛋白浓度时，应该重新测定并制作标准曲线。

表2   BCA法物质干扰及耐受的最大浓度