DoGene 细胞转染试剂
名称：DoGene 细胞转染试剂
规格：0.25mL / 1mL
价格：519元 / 1799元
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产品描述：
DoGene是经过特殊交联修饰的新一代阳离子聚合物，其高密度阳离子基团与带负电的核酸结合形成致密的纳米复合物，通过内吞入胞。在细胞内DoGene有效缓冲内吞体的pH，保护核酸免受降解，并高效介导基因转运到胞浆胞核表达。DoGene比血清转染效率更高，并允许细胞在铺板时或铺板后立即转染，其卓越的in vitro转染能力堪比 jetPEI、Lipofectamine2000、ExGen 500、FuGENE、Polyfect、SuperFect 等转染试剂。DoGene是广谱转染试剂，可转染的细胞包括A497、A549、BHK、Caco-2、C-26、C2C12、C3H/10T、CHO、COS1、COS7、Sf9、HeLa、HEK293、HT-29、MCF7、NIH3T3、Jurkat、K562、RAW264.7、THP1、U937、PC12、L929、SHY-5Y、Vero、原代神经元、原代肝细胞、皮肤成纤维细胞、人牛血管内皮细胞、单核/巨噬细胞和人胚胎干细胞等。
使用说明：
自备试剂：无菌150 mM NaCl，即0.9%生理盐水或无菌蒸馏水或PBS缓冲液，用于离体细胞转染制备转染混合物。5%无菌葡萄糖，用于离体或在体转染转染混合物制备。与复合物颗粒形成有关，勿用其它缓冲液替代。
DNA、siRNA和寡聚核苷酸：建议溶于无菌蒸馏水。质粒DNA高纯度OD260/280 ≈1.8，无内毒素。可用内毒素清除剂清除内毒素。寡聚核苷酸和用于RNA干扰（siRNA）的核苷酸，可单独或与质粒DNA共转染，但必须使用经HPLC或凝胶洗脱纯化去除杂链的高纯度片段。siRNA和寡聚核苷酸与DNA转染及优化操作相似，但对其用量进行细致的优化很重要。
细胞准备：
接种细胞数：参见附表细胞计数接种。
培养时间：转染前应培养24 h左右，使之处于分裂和对数生长期。
细胞密度与转染时机：培养24 h后，细胞覆盖培养皿表面积的70%～90%时为转染最佳时机。虽然低密度细胞的转染率并不低，但总细胞数少因而蛋白表达总量也不会很高。在细胞密度较高时转染较好，但100%长满的细胞转染效率很低，因此接种细胞要均匀，以减少因局部紧密接触而致生长抑制的难转染细胞，否则最好重头接种细胞。DoGene允许在细胞铺板时或铺板后立即转染，效果与贴壁后转染相似，省时省力，适合高通量筛选。甚至一些难转染细胞也可尝试此即时转染方法。
血清和培养基：DoGene具有卓越的转染能力，血清和抗生素不影响转染，在10%～30%血清培养基转染表达效率更高。转染混合物体积为培养基的1/10，参见表第5栏。如果培养基未明显变黄，转染前可不更换。如转染结果满意，转染后无需更换培养基。但转染混合物稀释了培养基，转染4～8小时后换培养基会增加转染效率。
DoGene和DNA用量及优化
任何转染和优化方案需考虑转染试剂量、DNA量、但关键是二者所带的电荷比charge ratio简称R，即转染试剂所带正电荷基团相对于核酸负电荷磷酸基团的当量比率。通常R>3时DNA复合物带正电荷可被转染。在操作上，R值规定了二者的用量比例，适宜的R值因细胞类型和细胞密度而异。
对于离体细胞转染，DoGene用量和R值的计算公式如下：
DoGene体积/µL = 0.4×R×DNA量/µg
R = 2.5×DoGene体积/µL ÷ DNA量/µg
初次转染推荐设定R=6或R=8（附表灰色栏）在24孔板进行转染优化，确定最佳转染方案。在DNA量固定时，对R值的优化相当于优化DoGene用量，建议设定R=5、7、9或者R=6、8、10三档。确定转染效率最高的R值后，再优化DNA用量。附表建议的DNA量已接近所列细胞数的中上限，但仍可进行50%的增减；对难转染的巨噬细胞、原代细胞、悬浮细胞等可在较大范围增减DNA用量（0.5～5 µg DNA/1×105细胞），再按公式计算DoGene用量。例如RAW 264.7巨噬细胞的DNA量可参照附表加倍并设R=8计算。DNA和转染试剂的量越大，转染表达量越高，但达到高峰后因毒性增加表达反而下降。DoGene在R<15时几乎没有细胞毒性，因而无需为降低毒性而优化。
贴壁细胞转染（以24孔板为例，参见表一）
1. 参见表一第4、5栏。将1 µg DNA稀释于100 µL无菌生理盐水或无菌蒸馏水或PBS缓冲液（自备，勿用其它缓冲液，但可用5%葡萄糖代替），可振荡混匀。
2. 取2.4 µL DoGene加至DNA溶液，勿用相反的加样顺序。立即振荡混匀，低速瞬时离心将液体甩至管底。
3. 室温放置15分钟。
4. 将100 µL转染混合物直接加至1 mL含血清培养基中（参见表一最右栏），倾斜转动培养板混匀。转染前可不更换培养基。
5. 培养24～48小时检测基因表达，或1∶10传代后加抗生素筛选。转染后无需更换培养基。但转染混合物稀释了培养基，转染4～8小时后换培养基可进一步增加转染效率。
表一 DoGene 贴壁细胞加样和优化表
细胞
DNA与稀释
DoGene 体积/µL
培养 基体 积 /mL
培养皿
面积 /cm2
接种细胞
DNA /µg
生理盐水
无菌蒸馏水
PBS缓冲液 /µL
R=5
R=6
R=7
R=8
R=9
R=10
96-well
0.3
1.5×104
0.25
20
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0.2
48-well
1
5×104
0.5
50
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0.5
24-well
2
1×105
1
100
2
2.4
2.8
3.2
3.6
4
1
12-well
4
2×105
2
100
4
4.8
5.6
6.4
7.2
8
1-2
6-well 35-mm
10
4×105
3
200
6
7.2
8.4
9.6
10.8
12
2-4
60-mm 25-cm2
28
8×105
5
500
10
12
14
16
18
20
5-10
100-mm 75-cm2
75
2×106
10-15
1000
20-30
24-36
28-42
32-48
36-54
40-60
15
注：计算公式 DoGene体积/µL= 0.4×R×DNA量/µg
贴壁细胞在铺板时转染、或铺板后立即转染
1. 细胞准备：用含血清培养基洗涤消化的细胞，去除消化酶。用含血清培养基制备细胞悬液，细胞量稍大些，以转染后24 h细胞生长密度达90%，或转染48 h内完全长满为宜。
2. 制备转染混合物，参照表一和上述贴壁细胞转染步骤。
3. 铺板后立即转染：将细胞悬液加到培养皿中，然后立即加入DoGene-DNA转染混合物，混匀。
4. 铺板的同时转染：将DoGene-DNA转染混合物预先加到培养皿中，然后立即加入细胞悬液。
5.培养24～48小时检测基因表达。
悬浮细胞转染
以24孔板 Jurkat淋巴细胞、K562为例。
1. 按照表二准备细胞和DNA。使用含血清培养基。通常悬浮细胞转染DoGene和DNA用量比贴壁细胞要大。初始转染推荐R=6，随后可根据转染效率设R=6、7、8、9、10 优化。注意Daudi和Molt 4转染DNA量参见表二再适当增加约30%并设R=8按公式计算DoGene量。
2. 悬浮细胞转染：参见贴壁细胞转染方法制备转染试剂和DNA混合物，室温放置20分钟后直接加至1 mL含血清培养基的细胞悬液中。培养24～48小时进行后续实验。
表二 DoGene悬浮细胞加样和优化表
细胞
DNA与稀释
DoGene 体积/ µL
培养基体积/mL
培养皿
面积/cm2
接种细胞
DNA /µg
生理盐水
无菌蒸馏水PBS缓冲液/µL
R=6
R=8
R=10
96-well
0.3
3 × 104
0.3
20
0.72
0.96
1.2
0.2
48-well
1
1 × 105
0.8
50
1.92
2.56
3.2
0.5
24-well
2
2 × 105
1.5
100
3.6
4.8
6
1
12-well
4
4 × 105
3
100
7.2
9.6
12
1-2
6-well 35-mm
10
1 × 106
6-12
200
14.4
19.4
24
2-4
60-mm 25-cm2
28
2 × 106
10-20
500
24
32
40
5-10
100-mm 75-cm2
75
6 × 106
30-60
1000
72
96
120
10-15
注：计算公式 DoGene体积/µL= 0.4×R×DNA量/µg
产品特点：
1．血清抗生素兼容，转染前后可不更换培养基
2．细胞铺板时立即转染，节省时间
3．高效转染siRNA、DNA、寡聚核苷酸
4．in vitro 转染细胞谱广，包括各种原代细胞和神经元
温馨提示：
1、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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