酵母单杂交点对点
酵母单杂交点对点
一、 实验原理：
真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由 DNA 结合结构域
(DNA—binding domain，BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)。用于酵母单杂交系统的酵母 GAL4 蛋白是一种典型的转录因子，GAL4 的 DNA 结合结构域靠近羧基端，含有
几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与 RNA
聚合酶或转录因子 TFIID 相互作用，提高 RNA 聚合酶的活性。在这一过程中，DNA 结合
结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。在 GAL4 系统中构建与基因的 ORFs 融合
的激活结构域 GAL4-AD 的特异载体，顺式作用元件与 GAL4 的 DNA 结合结构域 GAL4-BD
融合构建载体，分别转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若与顺式作用元件发生相互作用时，
就会将 GAL4-BD 和 GAL4-AD 结合在一起，从而与上游激活序列(upstream activating
sequence, UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。
基因转录实际上是转录调控因子和启动子区各种顺式作用元件相互作用的结果，这种结合犹
如蛋白质与蛋白质的互作一样具有特异性，这是研究顺式作用元件即 DNA 序列与蛋白质
互作的基础。酵母单双杂交（点对点），最终结果是确定候选的 DNA-蛋白质是否存在相互
作用。
二、实验步骤
1. 准备酵母感受态细胞（LiAc Method）。
2. pGADT7 和 pHIS2 共转化酵母菌株 Y187，涂二缺平板，28 度恒温箱培养。
3. 挑取二缺平板克隆至三缺（含不同浓度 3-AT），28 度恒温箱培养。
三、实验结果：
1. 二缺和三缺平板原始图片拍照。
2. 原始图片整理图版。
创建时间：2020-11-26 16:11
