酵母单杂交文库筛选
酵母单杂交文库筛选
一、 实验原理：
真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由 DNA 结合结构域
(DNA—binding domain，BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)。用于酵母单杂交系
统的酵母 GAL4 蛋白是一种典型的转录因子，GAL4 的 DNA 结合结构域靠近羧基端，含有
几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与 RNA
聚合酶或转录因子 TFIID 相互作用，提高 RNA 聚合酶的活性。在这一过程中，DNA 结合
结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。在 GAL4 系统中构建与基因的 ORFs 融合
的激活结构域 GAL4-AD 的特异载体，顺式作用元件与 GAL4 的 DNA 结合结构域 GAL4-BD
融合构建载体，分别转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若与顺式作用元件发生相互作用时，
就会将 GAL4-BD 和 GAL4-AD 结合在一起，从而与上游激活序列(upstream activating
sequence, UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。
基因转录实际上是转录调控因子和启动子区各种顺式作用元件相互作用的结果，这种结
合犹如蛋白质与蛋白质的互作一样具有特异性，这是研究顺式作用元件即 DNA 序列与蛋白
质互作的基础。该实验目的是为了确定已知 DNA-蛋白质之间是否存在相互作用；分离结合
于目的顺式调控元件或其他短 DNA 结合位点蛋白的新基因；定位已经证实的具有相互作用
的 DNA 结合蛋白的 DNA 结合结构域，以及准确定位与 DNA 结合的核苷酸序列。
二、实验步骤
1.诱饵基因的自激活检测，检测通过后继续下一步实验
2.诱饵质粒转化酵母细胞，验证合格后再转化文库质粒
3.酵母筛选/3AT 条件优化
4.筛选结果的测序
三、实验结果：
1. 文库筛选报告（电子版），
2. 文库筛选图片（电子版），
3. 筛选测序结果和阳性克隆实物。
创建时间：2020-11-26 16:09
