免疫荧光（IF）实验操作流程

1.试剂和溶液

10X PBS：80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1L纯水，调pH至 7.4
洗涤液：1× PBS：纯水稀释10X PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS
固定液：4%多聚甲醛：4g多聚甲醛溶于100ml PBS
通透液：0.1% triton-100
封闭液：PBS配制的3% BSA
抗体稀释液：一抗稀释液：3% BSA；二抗及鬼笔环肽稀释液：1X PBS；DAPI: 纯水稀释

2.实验步骤

1	细胞爬片：将盖玻片在酒精灯上灼烧片刻灭菌，铺在12孔板中，然后接种细胞，置于37℃，5% CO2培养箱过夜，待细胞形态完全伸展开并且处于健康状态，细胞密度为40%-50%（做爬片的细胞一般是复苏细胞传代2代后的细胞）；
2	洗涤：倒掉细胞培养液，1×PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min；
3	固定：4%多聚甲醛固定细胞，室温放置20min,倒掉多聚甲醛，加入适量PBS；
4	冻存：-20℃保存（如果直接使用，可跳至7）；
5	解冻：常温下放置30 min；
6	洗涤： PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min；
7	通透：加入适当体积的通透液室温放置10min。（若蛋白为膜表达则无需此步）
8	洗涤：PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min；
9	封闭：加入适当体积的封闭液，室温放置30 min；
10	一抗孵育：倒掉封闭液，加入适当体积及浓度的一抗，37℃孵育60min；
11	洗涤：PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min；
12	二抗孵育：加入适当体积及稀释比的荧光二抗， 37℃避光孵育50 min；（如果一抗是荧光素标记的则无需此步）；
13	洗涤：PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min；
14	核染色：加入适当体积及稀释比的核染料DAPI室温反应10min （如果无需加鬼笔环肽，可洗涤后跳至16）；
15	洗涤：PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min；
16	细胞骨架染色：此步骤只针对有细胞核定位的项目；加入反应体积为0.2ml，适当稀释比的鬼笔环肽，避光37℃孵育60 min或4℃孵育过夜；
17	洗涤：PBST轻微振荡洗涤2次,每次5min，纯水轻微振荡洗涤5min；
18	封片：取干净的载玻片，分别标记和编号，在载玻片上滴加适量防荧光猝灭封片剂，用镊子取出盖玻片，细胞面朝下，盖在载玻片上；
19	荧光显微镜观察，记录结果。

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