免疫印迹（Western Blot）实验方案
一、材料
高效RIPA组织/细胞裂解液、蒸馏水、双蒸水、30%聚丙烯酰胺、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%过硫酸铵（APS）、TEMED、预染marker、电泳缓冲液、甲醇、转膜缓冲液、PVDF膜、丽春红染液、5%脱脂奶粉、牛血清蛋白(BSA)、Tris缓冲盐溶液(TBS)、吐温-20、一抗、二抗、ECL发光液
研钵、离心管、细胞刮、离心机、磁力搅拌器、电泳仪、转膜用的夹子、海绵、滤纸、PVDF膜、半干转仪、摇床、计时器、培养皿
二、实验内容
1 提取蛋白
1.1 贴壁细胞提取总蛋白：
从细胞间取出处理后的细胞，弃去培养液，生理盐水/PBS冲洗3次，加入RIPA裂解液（6孔板每孔约200μL），冰上放置20-30min ，细胞刮刮细胞后用移液枪移至2ml离心管中（也可用胰酶消化后将培养基或PBS将细胞收集至离心管，离心1000/5000 rpm，4℃，5min后，弃掉上清加RIPA,冰上裂解20~30min），离心12000/13000 g，4℃,10min。离心后取上清于另一个2ml离心管中，加5×上样缓冲液，100℃金属浴加热变性5~10min，冰上静置一会后放-20℃短期保存（-80℃可长期保存）。
1.2 液氮提取组织蛋白：
将研钵、手术器械置于冰上预冷，将组织从液氮中取出来，剪目的蛋白称重后置于研钵，加入液氮研磨，期间若样本冻融却不成粉末状，则再次加入液氮研磨，直至加入液氮研磨，研磨后移置2ml离心管中，按每10mg样品+100μL RIPA裂解液（内加1%的PMSF）的比例加入裂解液，混匀后冰上放置20~30min。离心12000/13000 g，4℃，10min。离心后取上清于另一个2ml离心管中，加5×上样缓冲液，100℃金属浴加热变性5-10min，冰上静置一会后放-20℃保存。
1.3 超声粉碎提组织蛋白：
从液氮中取出来，称取组织100mg+10至2ml离心管中，加入1ml预冷的生理盐水/PBS（冲洗血），摇一摇，离心（13000rpm，10min，4℃）弃上清，加1mlRIPA裂解液，超声（超声功率40%~50%，10s左右）超声后冰上放置20-30min。离心12000/13000g，4℃，10min。离心后取上清于另一个2ml离心管中，加5×上样缓冲液，100℃金属浴加热变性5~10min，冰上静置一会后放-20℃保存。
2 蛋白定量
BCA蛋白浓度测定的原理是蛋白质分子中肽键结构在碱性环境下能与Cu2+生产络合物，并将Cu2+还原成Cu+，而BCA试剂可以特异性地与Cu+结合，形成稳定的有颜色的复合物，并在562nm处有最大的光吸收值，该复合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可以根据吸收值的大小来测定蛋白的含量。
3 凝胶电泳
3.1清洗玻璃板，烘干，组装。
3.2验漏
加双蒸水约7ml，静置2min，注意液面是否下降。倾倒水后用滤纸将水吸干。
3.3灌胶
①配制下层分离胶（R）冰上操作。每块板大概4.5~5ml，APS和TEMED后加，加入TEMED混合均匀后,快速加入玻璃板中。APS现用现配。℃分装，减少挥发。凝胶配方见附表。
②加下层胶+双蒸水等待30 min（作用：一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上;二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。注意：下层胶与水层出现分离线即可弃去水层，用滤纸吸干，等待加上层胶。整个过程不要有气泡产生。若有，将气泡赶出）
③配制上层浓缩胶（S）(每块板大概1.5~2ml，APS和TEMED后加，加入TEMED混合均匀后, 加入外离胶的上面,加满后,将梳子小心地插入玻璃板中等20~40min即可凝固。
⑷等待浓缩胶凝固后，取下玻璃板，用水清洗玻璃板外的胶，组装玻璃板（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外），将1×电泳缓冲液倒入支架槽，两手持梳子的两侧边缘,均匀的将梳子将梳子平衡拔出，否则梳子孔会倾斜,在拔梳子的过程中如果梳子孔出现倾斜,用细的注射器针头拨正即可;凝胶要现用现配,如果放置时间长,凝胶会发生收缩而影响条带的质量将胶板置于电泳槽中。（也可将胶连同梳子一块放入一次性手套，在梳子周围加1×电泳缓冲液，密封，4℃过夜）。
3.4蛋白质电泳分离和转膜
电泳
95℃加热样品5min后离心1min。（蛋白样品的变性进行蛋白印迹实验时,所需的蛋白质是变性）将蛋白样品小心加入加样孔中,同时一个孔加入3~10μL蛋白Marker作为对照。（注意：加样器吸取样品时不要有气泡,加样时不可太快,否则会使样品溢出,影响上样的一致性;加不同的样品时,要换加样器针头,或将加样器在外电泳槽中洗涤3次，以免交叉污染）恒压80V，于电泳缓冲液中（电泳电泳液要漫过内侧的玻璃板）, 待溴酚兰指示剂进入分离胶调至100~120 V（目的是根据蛋白分子量的不同使蛋白样品跑开）直至溴酚蓝跑至凝胶底端,关闭电源，结束电泳。
转膜
①湿转
取出凝胶,铺好转膜三明治,于恒压100V（或恒流350mA）的条件下湿转90min，实验表明恒压效果更好。(转膜效果可采用丽春红染色检查检测后可用PBS清洗后用于后续实验。）转膜后用1×TBST洗5min/3次，摇床中进行，转速为80~120。（tween是表面活性剂，主要是除去非特异性相互作用的蛋白）
（注意： PVDF膜得用甲醇浸泡1min，目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合；转膜液现用现配，配好后4℃预冷；转膜时所用的滤纸、海绵都用转膜液泡湿，转膜期间无气泡；滤纸、凝胶、PVDF膜的大小一致,否则会影响电流的通过；蛋白是从负极到正极，注意PVDF膜与胶的顺序，以免蛋白转至滤纸，转膜夹子的黑面朝下，默认为负极，要保证凝胶靠近负极PVDF膜靠近正极，顺序为： 1层海绵--4层滤纸--凝胶--PVDF膜--4层滤纸-1层海绵；凝胶不分正反面,PVDF膜的正面为紧挨着凝胶的一面，转膜后标记膜的正反正面以及上下面以便于后续实验的进行）
②半干转
将膜放入BIO-RAD半干转仪器，设置电压25V，电流1.3A转膜，转膜时间由所需蛋白分子量、胶的浓度，上样孔数综合决定（半干转需要在转膜前根据需要将胶裁开，防止转过，转膜时间见附表4）。
3.5抗体孵育和显色
封闭
5%的BSA/ 5%的脱脂奶粉封闭1~2h，摇床转速用40，室温25℃。（也可4℃过夜，过夜是指8h以上，根据需要可把膜剪开,以便孵育不同的抗体）
一抗
一抗（要让膜的正面与一抗完全接触，以便一抗和目的蛋白充分结合；一抗可重复利用，用BSA或者1×TBST稀释，其中BSA稀释可保存较长时间）过夜孵育后，将PVDF膜在TBST中漂洗5-10min/3次，洗膜时在摇床下水平进行，使膜的各个部位洗的比较均匀,以除去未结合的抗体。尽量将膜分开洗，因为膜之间会发生摩擦,把结合的抗体磨掉；膜的两端一定要保证有小段膜是空白的,这样既便于夹膜,又可对里面的蛋白起保护作用；在夹取膜时尽量不要夹有蛋白的地方
二抗
常用的二抗有鼠二抗、兔二抗、山羊二抗等。加入5%脱脂奶粉（或1×PBS）稀释的HRP标记二抗孵育1~2h摇床转速用40（以保证二抗能与一抗充外结合），室温25℃，孵育后，将PVDF膜在TBST中漂洗5~10min/3次。
显色
根据膜的大小，多少配制发光液（稳定剂和增强剂按1:1），利用化学发光成像系统,对蛋白条带信号进行采集和观察，最后保存（膜应正面朝上将发光剂均匀地滴在膜上）。
成像系统获得蛋白条带后及时保存、备份。
三、讨论
1. 结果中的背景为什么较高？可能的原因及建议
（1）膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
（2）一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
（3）一抗孵育的温度偏高——建议 4℃结合过夜。
（4）膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
（5）检测时曝光时间过长——减少曝光时间。
2. 结果中杂带较多？可能的原因及建议
（1）样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
（2）上样量过高，太敏感——适当减少上样量。
（3）一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。
3.结果中无信号或显示信号弱(曝光时出现样本模糊字样)，可能的原因及建议
（1）检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
（2）检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
（3）转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
（4）抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
（5）一抗孵育时间不足——建议4℃结合过夜。
（6）二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。
（7）洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.1%的弱去垢剂 Tween-20。
4. 其它现象：
（1）膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。
（2）反白（条带显白色）——目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。
（3）蛋白分子量偏低或偏高——胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。
⒌" 微笑"(两边翘起中间凹下)形带原因?
（1）由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中——灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓，待其充分凝固再作后续实验。
（2）蛋白上样量大的时候，会出现手拉手的现象——上样时应尽量减少上样体积。
（3）电泳时产热过多，凝胶温度过高造成——降低电泳时的电压或者加冰块冷却缓冲液。
⒍ "皱眉"(两边向下中间鼓起)形带原因?
主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法:可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
⒎ 为什么带出现拖尾现象?
主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。此外可能是灌胶时分离胶过多导致浓缩胶很少，不能起到浓缩作用，没有把样品压成一条线。——加样前离心;选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长，重新配制;降低凝胶浓度;灌胶时分离胶不要过多。
8. 什么是"鬼带"，如何处理?
"鬼带"就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。——在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
9. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用?
我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。——更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。
10. 为什么电泳的条带很粗?
电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。——适当增加浓缩胶的时间;保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压;
11.凝胶时间，或慢或快，怎么回事?
通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。——APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。
如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。
（夏天温度高，凝胶时间短，可适量减少APS以及TEMED用量，冬天可适量增加APS以及TEMED用量）
四、溶液配方
westernBlotting中用到液体的配方：
①APS：10%的过硫酸铵0.1g+1mldd水
②电泳缓冲液（5×Electrophoresis buffer:7.5gTris+47gGlycine+2.5gSDS，加ddH2O定容到500ml），用时稀释为1×缓冲溶液。
③半干转转膜液：1LTransfer buffer Trans-BlotRTurbo TM 5×Transfer buffer：200ml 5×Transfer buffer+600ml nanopure water+200ml ethanol乙醇，1：3：1，ddH2O在中间加，Transfer buffer和无水乙醇一块加会有结晶。
④10×湿转转膜液：30.35gTris+144gClycine加ddH2O至1000ml（PH8.8），用时稀释为1×缓冲溶液：100ml 10×转膜液+750ddH2O+150ml甲醇，提前放4℃预冷。
⑤5%的脱脂奶粉：5g脱脂奶粉+100ml1×TBST
⑥5%的BSA:0.25gBSA加1×TBST定容到5ml
⑦10×TBS（PH7.4）：12.1gTris+40gNacl定容到500ml
⑧1×TBST：100mlTBS+900mlddH2O+1ml Tween-20，磁力搅拌器摇匀。
